高通量测序中，每测一个碱基会给出一个相应的质量值，这个质量值是衡量测序准确度的。碱基的质量值13，错误率为5%，20的错误率为1%，30的错误率为0.1%。Q20与Q30则表示质量值大于等于20或30的碱基所占百分比。比如一共测了1G的数据量，其中有0.9G的碱基质量值大于或等于20，那么Q20则为90%。
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Q20和Q30其实是测序质量打分的硬指标，简单说就是看每个碱基被测对的概率有多高——Q20代表错误率不超过1%，也就是99%的准确率，而Q30更狠，错误率压到1%以下，准确率高达99%！这俩数值不是随便写的，是根据碱基识别时荧光信号信噪比算出来的Phred质量分，Q值每+10，错误率就降一个数量级。实际做实验时，如果下机数据Q30占比不到70%，很多老师都会皱眉头，觉得数据不够稳，尤其做单细胞或者低频突变检测时，Q30简直就是生命线！
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比如测一个10G的人类外显子，Q20下可能多出上百万个错配位点，而Q30能把这种噪音压到十万级别。而且不同平台差异很大，NovaSeqX号称Q30≥85%，但实际样本GC偏高或甲醛交联过度时，末端Q值经常断崖式下跌，所以我们现在上机前必跑预实验，就为盯着Q30曲线别塌腰！
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其实Q20/Q30就是测序仪给每个碱基打的可信度分数，Q值=?10×log10(错误概率)，所以Q20对应错误率10??（1%），Q30就是10??（1%）。别小看这10分差距，相当于1000个碱基里允许错1个vs100个里错1个！我们组上周建库失败就是因为接头污染导致末端Q值暴跌，最后Q30从85%掉到52%，生信那边直接拒收数据……现在发文章审稿人第一眼就盯Q30均值，低于80%都得补实验！
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打个比方吧，Q20就像考试考了80分，基本及格但小错不断；Q30就是99分，接近完美——它代表每个碱基测错的概率分别控制在1%和1%以内。这个Q值不是实验室随便标着玩的，是仪器实时分析每个循环的图像亮度、背景噪声、簇分离度后算出来的Phred分，越往后测序越容易出错，所以Q30比例高低直接决定你后续比对、变异检出靠不靠谱，特别是做液体活检找1%突变频率时，没够高的Q30根本不敢往下分析！